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『锐帮读』小鼠肠道微生物16S全长测序 VS 短读长测序

2023-05-10 14:56:27

导读：随着医学和医疗行业的发展，从自然和临床样本中更快和更准确分析微生物群落的需求不断增加。目前，领先的二代测序技术已实现更高的精度和更大的数据量，促进了各种微生物群落的研究。但是，由于16S rRNA扩增子序列的高度相似性，短读长测序往往限制了微生物在“种”水平上的分析。第三代测序平台通过长读长测序，很好地克服这个限制。本研究阐释了16S rRNA短读长测序和全长扩增子测序对小鼠肠道微生物群的分析。


文献ID

Analysis of the mouse gut　microbiome using full-length 16S　rRNA amplicon sequencing

期刊：Scientific Reports
年份：2016    IF：5.58
通讯作者：Jongoh Shin, Sooin Lee
单位：Department of Biological Sciences and KI for the BioCentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology
邮箱：bcho@kaist.ac.kr

材料与方法
样品来源：2只50周龄的健康小鼠(A、B)的粪便。
测序策略：16S rRNA V3-V4（469 bp）文库，使用Illumina MiSeq PE250测序；16S rRNA全长文库，使用三代测序（MinION纳米孔测序）。

研究成果
1. 测序序列和数据参数统计
A、B小鼠短读长测序得到105590条和92119 条clean reads (去除平均质量值低于20的Reads，平均读长447bp)。
A/B小鼠16S全长测序得到36166条和11078条 clean reads（平均读长1393bp）。
短读长测序数据质量（QC值）更高。
图1. 测序方法流程及测序数据量
A. 两种测序方法流程图：使用16S全长测序的和V3-V4短读长测序；
B. 两种测序方法的碱基质量分数分布图 ；
C. 两种测序方法的序列读长统计图。

2. 物种注释统计
A、B小鼠短读长测序聚类得到1055和978个OUT（97%）。
A、B小鼠全长测序使用GreenGene数据库进行注释，分别有15%和19%的序列注释到可识别分类单元（taxonomic units）。

3. 微生物组成比较
两种测序平台，均注释到8个细菌门，13个细菌纲。两种测序平台在门（R2 = 0.850，p= 0.003）和纲水平（R2= 0.829，p< 0.0001）存在显著的正相关性。

图2. 两种测序方法的微生物组成比较

A. 老鼠粪便样本基于短读长测序的ＯＴＵｓ（９７％）稀疏曲线。

B. 两种测序的序列分别注释到目、科、属、种的物种分类单元的比例。

C. 维恩图解显示A和B样品之间短读长测序共有和特有的种系型。

D. 维恩图解显示A和B之间全长测序共有和特有的种系型。
E. 维恩图解显示短读长测序（Illumina ）和全长测序（Nanopore）之间共有和特有的分类单位门。
F. 维恩图解显示短读长测序（Illumina）和全长测序（Nanopore）之间的共有和特有的分类单位纲

4. 从目到种水平的物种差异
两种测序平台，在大部分优势分类单元上的物种相对丰度均有较高的相似性，目水平相关系数和显著水平分别为R2= 0.8851，p< 0.0001（spearman相关性分析）；科水平R2= 0.9086，p< 0.0001；属水平R2= 0.8354，p< 0.0001；种水平R2= 0.5389，p= 0.0124。两种测序平台均含有的物种，其中89%物种丰度没有显著差异，除一个种系型和三个分类单元的物种丰度存在显著差异。另外，全长测序能够在种水平上更加准确的识别物种。

此外，在一些分类级别上物种的相对丰度存在差异，分类单元从目到种，两种测序平台均含有的物种和短读长测序特有的物种比例，逐步降低。
图3. 物种差异
A. 热图展示两种测序平台在目、科、属、种水平的物种平均相对丰度。
Ｉ柱代表短读长测序，Ｎ柱代表全长测序。Ｉ柱和Ｎ柱颜色代表物种相对丰度从0%到100%不等，见左下角的颜色图。+ /−柱颜色代表短读长／全长测序物种相对丰度的log2值，见左下角的颜色图。黑色框内物种代表两种测序平台中该物种相对丰度有现在差异。
I、II、III代表物种的三类分类。I分类代表两种测序平台均含有的物种，II代表全长测序特有的物种，III代表短读长测序特有物种。Spearman相关系数展示了两种测序平台物种显著相关(* p < 0.05, * * * * p < 0.0001)。
B. 代表I到III组在目、科、属、种各分类水平的比例。

5. 小鼠肠道微生物群系统发育树分析
为了确定读长对微生物注释的影响，挑选进化距离最相近的16个种（属于13个属）的序列通过最大似然法进行物种发育分析，发现4个种从它的属中分离出来。这意味着，在97%的相似度进行OUT聚类，并挑选代表序列对其进行注释，并不适用全部物种。说明V3-V4区测序在种的水平分析物种组成存在不足，而全长测序有这方面优势。
图4. 微生物群系统发育树
A. 本研究使用最大似然法进行物种系统进化聚类，得到进化距离最相近的16个种．灰色代表两种测序平台均含有的物种，黄色代表全长测序特有的物种，蓝色代表短读长测序特有物种。
B. 在16 s rDNA基因上可区分两种水平的位点用垂线表示，黑色和红色的箭头分别表示V3-V4区测序和全长测序的引物设计位点。

研究结论
16S全长测序和V3-V4短读长测序比较显示，物种主要分类单位（89%）没有显著差异，除一个种系型和三个分类单位水平上存在显著差异。此外，除“种”的水平以外，两种测序平台在其他分类水平上均有高度相似性。在“种”的水平，全长测序比短读长测序可以识别更多的种，促进细菌群落组成的准确分类。因此，在不同的自然和临床样本中，16S rRNA全长扩增子测序的方法将有助于快速、准确、有效地检测微生物多样性。

亮点
探讨宿主和微生物群之间的关系时，有若干种方法可检测自然和临床样本的微生物群落组成。特别地，肠道微生物群的组成已经阐明可使用宏基因组和16S rRNA扩增子测序方法，后者是最常用的。该研究利用第三代测序的优势，采用16S全长测序方法，检测老鼠粪便样本的微生物组成。尽管PacBio测序数据产量和质量较低，但是其超长的测序读长已经展示出更准确微生物群落组成鉴定优势。


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供稿：马荣荣
编辑：王丽燕

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